Раздел 9: Конфокальная микроскопия для визуализации по глубине

Рамановский микроскоп использует конфокальную оптическую систему, которая позволяет проводить анализ по глубине. Его разрешение по глубине составляет от 1 мкм до нескольких мкм. Это позволяет анализировать посторонние веществ, внедренных в смолу, определять трехмерную форму объекта и анализировать толщину слоев.

Пространственное разрешение конфокального микроскопа (включая рамановский микроскоп) определяется размером линзы объектива и конфокальной точечной щели, когда длина волны лазера фиксирована. Когда размер отверстия достаточно мал,

разрешение по оси X:

разрешение по оси Z:

где λ - длина волны, N.A. - числовая апертура, а n - показатель преломления (обычно n = 1, при погружении в масло n = от 1,3 до 1,4). (2а), когда N.A. мало,

разрешение по оси Z:

А и В являются константами, определяемыми размером щели. A = 0,37, B = 0,64, когда точечное отверстие бесконечно мало, но на самом деле его нельзя сделать бесконечно малым, поэтому A = 0,4, B = 0,68 для RAMANtouch и разрешение измеряется размером отверстия. Когда устройство выпускается, значениями по умолчанию являются A = 0,48 и B = 0,82 для размера отверстия и ширины щели.

Выражения (1), (2a), (2b) могут быть использованы, когда размер точечного отверстия достаточно мал. Это означает, что размер точечного отверстия представляет собой размер диска Эйри лазерного пятна, отображаемого на точечном отверстии. Взаимосвязь между размером отверстия и константами A и B более подробно описана ниже.

Коэффициенты A и B, которые определяют разрешение в предыдущем разделе, зависят от размера точечного отверстия, но на самом деле они зависят от относительного значения, а не от абсолютного значения. Эта относительная величина представляет собой размер точечного отверстия относительно диска Эйри (AU) лазерного пятна, отображаемого на точечном отверстии.

Диаметр точечного отверстия

Если проекционное увеличение образца на поверхности точеного отверстия составляет M, диск Эйри лазерного пятна равен

Увеличение М проекции определяется увеличением объектива и системы линз от объектива до точечного отверстия. Единица размера отверстия, полученная делением размера отверстия на размер этого диска Эйри выражается в AU (единица Эйри).

В нашем лазерном рамановском микроскопе RAMANtouch проецирования M почти такое же, как увеличение объектива, поэтому оно находится в точечном отверстии, когда лазер с длиной волны 532 нм фокусируется объективом со 100-кратным увеличением (NA = 0,9). Воздушный диск 1,22 * 100 * 532 нм / 0,9 = 72 мкм. Если размер отверстия составляет 50 мкм, относительный размер отверстия составляет 0,7 AU.

Рамановские сигналы очень слабые и для анализа спектра необходима достаточная мощность сигнала. Следовательно, необходимо использовать точечное отверстие с максимально возможным размером, но в то же время для измерения образцов с высоким разрешением при анализе по глубине необходимо установить размер точечного отверстия как можно меньшим. Фигура в левом нижнем углу показывает пропускание рамановского света, который проходит через отверстие относительно его размера. Нижняя правая диаграмма показывает коэффициенты A и B в уравнениях (1) и (2) относительно размера точечного отверстия. Когда размер точечного отверстия и размер щели равны 1 AU, эффективность использования сигнала составляет 83,8% и 90,4% соответственно.